EMMA
Die Elektronenmikroskopie (EM) ist ein Mikroskopieverfahren, das Bilder mittels eines Elektronenstrahls erzeugt. Unterschieden werden zwei Verfahren, bei der entweder der Elektronenstrahl die Probe durchdringt, das als Transmissionselektronenmikroskopie bezeichnet wird, oder der Elektronenstrahl die Probenoberfläche kontinuierlich und schrittweise liest. Letzteres wird unter Rasterelektronenmikroskopie verstanden. Damit der Elektronenstrahl gebündelt und präzise die Proben erreichen kann, wird ein Hochvakuum verwendet. Der große Vorteil der EM liegt in seiner sehr guten und hohen Auflösung von Strukturen sowie der enormen Vergrößerung bis in den atomaren Bereich. Dadurch ist es möglich nicht nur zelluläre Strukturen zu betrachten und zu analysieren, sondern auch inter- und intra-zelluläre Vorgänge besser zu verstehen. Der Erfolg bzw. Misserfolg einer EM-Probenanalyse hängt im Wesentlichen von einer perfekten und einwandfreien Probenvorbereitung ab, weshalb eine sorgfältige und präzise Probenvorbereitung und damit eine optimale Nutzbarkeit des EMs für wissenschaftliche Zwecke von Nöten ist. Diese ist meist jedoch sehr aufwändig und zeitintensiv und beinhaltet zur Strukturerhaltung standardmäßig eine chemische Fixierung. Diese erhält zwar den Zustand der Zellen bzw. dem Gewebe, weist allerdings auch Nachteile auf, wie z.B. eine eingeschränkte Probendicke oder die Artefaktbildung. Um die Proben mittels EM untersuchen zu können müssen diese zudem im Vorfeld entwässert werden, um Interaktionen mit dem Elektronenstrahl mit Molekülen zu vermeiden und das Vakuum aufrecht erhalten zu können, das mit einer aufsteigenden Alkoholreihe vorgenommen wird. Zudem müssen die Proben sehr dünn geschnitten werden, damit der Elektronenstrahl diese durchdringen kann und ein Bild erzeugt wird, weshalb die Proben in Kunstharz eingebettet werden.
Mit dem neu angeschafften Equipment zur Probenvorbereitung können biologische und/oder medizinische Proben bestmöglich aufbereitet und ultrastrukturell analysiert werden. Hierzu zählt sowohl die konventionelle Probenaufbereitung als auch eine hybride Aufarbeitung der Proben mit flüssigem Stickstoff (Hochdruckgefrierung („High Pressure Freezing“, HPF) und Gefriersubstitution), die nun an der RUB implementiert und ermöglicht wird (Abb. 1).
Abb. 1: Schematische Darstellung der Probenaufbereitung. Die konventionelle EM-Probenaufbereitung umfasst den manuellen Prozess der chemischen Fixierung, eine Entwässerung sowie die Einbettung in Kunstharz (1.). Bei der Hybrid-Verarbeitung werden die biologischen und/oder medizinischen Proben zunächst mit flüssigem Stickstoff gefroren, um ihre Struktur zu erhalten, und anschließend langsam wieder aufgetaut, wobei der Wasseranteil durch den Austausch mit anderen Substanzen ersetzt wird. Am Ende liegen auch diese Proben im polymerisierten Kunstharz vor (2.). Abschließend werden in beiden Methoden die Proben getrimmt und ultradünn geschnitten. Bei den Probenvorbereitungen 3. und 4. werden die Proben ebenfalls eingefroren und direkt in ihrem nativen Zustand analysiert, wobei das TEM zum Einsatz kommt. Je nach Art und Größe der Probe wird entweder der Vorgang nach Schritt 3 oder nach Schritt 4 durchgeführt.
Durch die Kryofixierung per HPF bleiben zelluläre Bestandteile durch einen viel schnelleren Fixierungsvorgang bestmöglich erhalten, ohne große ultrastrukturelle Strukturveränderungen zu bewirken, dass eine noch genauere und detailliertere Probenanalyse zulässt. Komplexe Veränderungen in feinen Strukturen oder dynamische Vorgänge im Zellinneren können erfasst und analysiert werden. Die HPF-Anlage bietet zudem die Möglichkeit der Licht- und/oder Elektronenstimulation, sodass z.B. die elektrische Entladung in Nervenzellen zum Zeitpunkt des Gefrierens im Millisekunden-Bereich erfasst werden kann. Die Kryo-EM-Aufbereitung mittels eines automatisierten Gefriersubstitutionsprozessors ermöglicht eine schnelle und präzise Dosierung aller Reagenzien für die Gefriersubstitution als auch für die „Progressive Lowering of Temperature“ (PLT) Technik, dass ein kristallfreies Einbetten kleiner Zell- oder Gewebeproben möglich macht. Durch die Kombination aus HPF und Gefriersubstitution bleibt zudem die Antigenität sehr gut erhalten, dass eine zielgerichtete Immunogold-Markierung und Analyse, von z.B. Membranen, Bakterien, Zellorganellen oder Proteinen, erlaubt.
Derzeit wird die Bildakquise an dem über 30 Jahre alten Zeiss 910 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) vorgenommen. Künftig wird das Allround-TEM (Talos F200i) der Firma Thermo Fisher das Equipment-Team verstärken. Neben der klassischen 2D EM-Analyse ermöglicht das 200kV leistungsstarke Talos F200i TEM auch die TEM-Tomographie und damit eine 3D-Analyse. Zu diesem Zweck werden einzelne Aufnahmen der Probe aus unterschiedlichen Kippwinkeln aufgenommen und computergestützt verrechnet. Durch verschiedenste Software können Zielstrukturen des Tomogrammes identifiziert, rekonstruiert und analysiert werden. Zudem ermöglicht das Talos F200i Analysen unter kryogenen Bedingungen. Mithilfe eines Plunge-Freezers (Vitrobot, ThermoFisher) werden kleine Proben wie gereinigte Proteine, einzelne Zellen oder isolierte Zellorganellen ultraschnell vitrifiziert, um ihre Struktur optimal zu erhalten. Die Untersuchung erfolgt anschließend im TEM unter Einsatz von flüssigem Stickstoff. Darüber hinaus sind auch Single-Particle-Analysen möglich.
Die EMMA bietet die Möglichkeit der vollständigen Probenbearbeitung inkl. Bildakquise für Ultrastrukturelle Analysen aus dem Life Science Bereich an. Zudem erfolgt im Anschluss eine Nachbesprechung und Evaluation. Jede Prozedur und Geräteanwendung kann jedoch auch autark ablaufen, wofür die EMMA die entsprechende Person einarbeiten und anleiten wird. Inwieweit welcher Service in Anspruch genommen werden möchte und/oder kann, wird im Vorfeld in einem ausführlichen Gespräch ermittelt.
Hierzu verweisen wir auf unsere Kontaktperson und freuen uns Sie kennen zu lernen!
